Troisième fils de Henri Estienne, et gendre de Simon de Colines. Il fut élevé dans la connaissance des belles-lettres et des langues anciennes. Il travailla un peu dans l’atelier familial puis étudia la médecine à Paris auprès de Jacobus Sylvius en même temps que Vésale.
Médecin, il s’engagea ensuite dans la publication d’une anatomie illustrée avec son ami Estienne de la Rivière, chirurgien et graveur, et celui-ci commença la gravure des bois dès 1530. Avant de devenir lui-même imprimeur, il s’était consacré aux langues anciennes puis à la médecine. Lazare Baïf lui confia l’éducation de son fils et, à ce titre, l’emmena dans ses ambassades d’Allemagne et d’Italie, pour qu’il pût continuer ses soins à son élève. À Venise, Estienne se lia d’amitié avec Paul Manuce.
Il devient en 1542, docteur Régent de la Faculté de médecine de Paris. Il exerce la médecine jusqu’en 1550. On lui doit plusieurs découvertes anatomiques importantes en ostéologie, la découverte des trous nourriciers des os dont il a compris le rôle physiologique. En neurologie, il décrit le trijumeau, le nerf phrénique et la chaîne sympathique du pneumogastrique. Il est le premier à mentionner les valves veineuses du foie, en 1539, dans son livre De Dissectione Partium Corporis Humani Libri Tres.
En 1550, suite à la fuite de son frère Robert Estienne à Genève, il doit reprendre la direction de l’imprimerie familiale et signe son malheur. Il donna en 1551, d’après les manuscrits de la bibliothèque du roi et avec les caractères de Garamond la première édition du texte grec d’Appien. II eut presque aussitôt le titre d’imprimeur du roi. Cependant il fit de mauvaises affaires et fut mis au Châtelet pour dettes en 1561, et y mourut en 1564.
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