Peu après le règne de Léon X, la bibliothèque Vaticane se retrouve une nouvelle fois prise dans la tourmente de l’histoire. En 1527, le sac de Rome par les soldats Austro Espagnols détruit et détériore de nombreux ouvrages en particulier ceux qu’avaient amassés Nicolas V et Sixte IV.
Comme à chaque fois, la Bibliothèque se relève de cette perte qui peut être d’ailleurs considérée comme la dernière de son histoire. En 1587, Sixte V fait construire un nouvel ensemble de 5 salles, la grande salle Sixtine, la galerie Sixtine, les deux vestibules et la salle des écrivains, elles forment l’actuelle bibliothèque. Les 4 anciennes salles servent au Synode, le Conseil des Évêques.
La fin du 16ème siècle marque un brusque changement de la mission assignée à la bibliothèque Vaticane au siècle suivant. En 1517, les protestants lancent la Réforme qui sera suivie de la Contre-réforme des catholiques. Pour la bibliothèque, cela signifie un changement de mission.
Ce n’est plus une référence pour les humanistes, les savants ou les magiciens mais une arme au service de la guerre contre toutes les hérésies. En 1558, un nouvel Index est crée, celui des livres interdits. Toute personne qui lit ou publie un de ces livres est excommuniée. Sixte V déclare la fin du service de prêt. Paul V fait supprimer les pupitres en 1613, les livres sont conservés dans des armoires. La salle de lecture n’existe plus.
En parallèle, les bibliothécaires marquent de plus en plus d’intérêt pour les ouvrages fondateurs du christianisme que pour les classiques. Cette coupure avec le monde extérieur va faire le malheur d’un grand nombre d’auteurs pendant près de 3 siècles.
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