1ère enfant de Philippe le Beau et de Jeanne la Folle et sœur aînée de Charles Quint. Son grand-père n’est autre que Maximilien d’Autriche qui est aussi son parrain. Marguerite d’York, veuve de Charles le Téméraire, est sa marraine. A la mort de Philippe le Beau, Eléonore et ses frères et sœurs exceptée sa plus jeune sœur Catherine séquestrée par sa mère sont recueillis par Marguerite d’Autriche, leur tante, et passeront leur enfance aux Pays Bas. Elle porte aussi le nom de Eléonore d’Autriche, titre donné par le rang de son grand-père mais elle n’ira jamais dans ce pays.
A l’âge de 18 ans, elle s’éprend d’un jeune homme, le prince Palatin Frédéric , 4ème fils de l’Électeur Philippe de Bavière. Celui-ci, sans le sou, réussira tout de même à entrer au service de Philippe le Beau et à représenter Maximilien d’Autriche aux Pays Bas et cela même après la mort du père d’Eléonore. Il sera même décoré de l’ordre de la Toison d’Or [1]. Mais il ne sera jamais assez bien pour Eléonore aux yeux de son frère. C’est pourquoi il mettra tout en oeuvre pour faire cesser leur relation. Le prince Palatin retourna alors en Allemagne selon les ordres de Charles Quint. mais gardera néanmoins toujours un bon rapport avec lui. Dès lors, Charles Quint n’eut qu’une idée en tête, marier sa sœur aînée. Plusieurs partis acceptables lui vint à l’esprit, les rois de Pologne, de France et d’Angleterre.
En 1517, il promet sa sœur à Manuel 1er, roi du Portugal. Son futur époux étant pourtant âgé de 48 ans, laid et à moitié handicapé, elle accepta de l’épouser.
Ce sera chose faite le 13 juillet 1518. Elle l’épousa par procuration sans jamais l’avoir vu. Le mariage religieux a lieu à Lisbonne et fit d’elle la reine du Portugal. De ce mariage, elle eut 2 enfants. 3 ans plus tard, elle devient veuve et sa fille lui est enlevée par sa belle-famille.
En 1530, elle épousa François 1er en seconde noces. Ce n’était pas un mariage d’amour mais plutôt un gage de paix entre les 2 souverains.
Eléonore, pourtant aimera son époux qui ne lui porte aucune attention. Le roi n’hésite pas à s’afficher avec sa maîtresse, la duchesse d’Étampes.
En revenant de voir sa fille vivant au Portugal, elle décédera d’une violente crise d’asthme le 13 février 1558 à Talavera [2].